在經過了鳥羽伏見之戰爆發後，政府派和幕府派的戰爭已經是全面展開，屢戰屢敗的幕府軍不得不退到德川幕府的控制下的江戶。而在鳥羽伏見之戰中損失慘重的新選組，也一併退到了江戶重整旗鼓。此時的新選組已經是損失慘重，人員數量已經大不如前，但因為之前的傷者如今傷愈歸隊，所以新選組的人員恢復到了70人左右。但即便是面臨這樣的慘敗，新選組還是打算和幕府同生共死，全其忠義之名。

不過，有感於鳥羽伏見之戰的失敗，新選組的局長近藤勇和副局長土方歲三著手對新選組的作戰模式和軍制做出改革。鳥羽伏見之戰時的慘敗，讓新選組副局長土方歲三在鳥羽伏見之戰後說的那樣，“刀劍的時代已經過去，日後的戰爭將由槍炮主宰”，因此新選組全員開始換裝西式軍服，並且開始學習使用火槍和火炮，其目的是為了能夠和裝備火槍和火炮，接受過西式軍隊訓練的政府軍相抗衡。

不得不說，新選組的反應是十分迅速的，此舉確實可以讓他們在短時間內和對方相抗衡，這對於接下來的戰事是有幫助的。但是新選組的人力十分短缺，而且指揮結構也出現了不可挽回的破損，這主要是因為之前的鳥羽伏見之戰，再加上對叛變成員的清洗導致的。因此，新選組的副局長土方歲三在對新選組進行改革的同時，還不得不四處招募成員，以便於補充新選組本就捉襟見肘的兵力。

但也就是在新選組進行軍制改編時，壞訊息也是接踵而來，幕府軍則因為之前德川慶喜在鳥羽伏見之戰和大阪之戰中的脫逃而士氣低落，另一方面則是政府軍對幕府軍窮追不捨，大有一種要一鼓作氣蕩平德川幕府的態勢，其部隊已經開始向江戶進發。新選組固然決心要和政府軍決一死戰，而德川幕府的陸軍總裁勝海舟也和新選組的局長近藤勇在1868年2月28日會面，勝海舟帶來了幕府的命令，要求新選組改編為甲陽鎮撫隊，並前往甲府城阻擊政府軍攻勢。

勝海舟當然不是空手而來，他是給新選組帶來了補給和補充兵員的。勝海舟很慷慨的為新選組提供了三百支法國產的前裝步槍、兩門法國4磅前裝火炮和軍資5000兩，另外還為新選組提供了200名補充兵員。同時，勝海舟還丟擲了一個讓新選組局長近藤勇無法迴避的條件——若近藤勇率軍守住了甲府城，則他可以被幕府封為大名，甲府城也就成為了他的封地。

試衛館出身的近藤勇無法拒絕勝海舟開出的條件，他實在太想成為大名了，故此率領改編為“甲陽鎮撫隊”的新選組在3月1日向甲府城開進。但是這一路免不了要翻山越嶺，勝海舟給的兵員又都是在連續失敗中幾乎喪失鬥志的潰兵，所以他們的行軍速度是怎麼樣的完全可以推測。後世說甲陽鎮撫隊的行軍速度緩慢，是因為近藤勇一路上大肆宴請賓朋是不正確的，因為甲陽鎮撫隊實際上是以每天20左右公里的速度在強行軍，考慮到甲陽鎮撫隊的兵員狀況，再加上時代限制和山路難行，那麼甲陽鎮撫隊的速度並不算慢了。

而近藤勇不知道的是，甲府城已經在3月4日投降了政府軍，政府軍約3000人的兵力已經進入到了甲府城之中。眼見甲府城已經被政府軍佔據，甲陽鎮撫隊只能退守勝沼待援，但惡劣的情況在於，因為甲府城落入政府軍手中的訊息擴散，所以甲陽鎮撫隊內的補充兵開始逃散，近藤勇極力安撫部隊，並聲稱會津藩援軍將在不久後抵達。可實際情況是，前往神奈川尋求援軍的土方歲三無功而返，對方拒絕出兵援助甲陽鎮撫隊。

3月6日，甲州勝沼之戰爆發，政府軍自對甲陽鎮撫隊展開了攻勢，甲陽鎮撫隊將本陣設立在了柏尾橋，同時分兵防守本鎮北側的觀音阪、南側巖崎山陣地、巖崎山和柏尾山之間的峽谷等險要之地。近藤勇在戰術上本身沒有錯誤，可是甲陽鎮撫隊內的補充兵員素質太差，補充兵員在戰鬥開始後就因為承受不住政府軍的優勢兵力和火力而出現了潰逃者，各處陣地也在政府軍的攻勢下相繼失守。

面對政府軍的攻勢，原身為新選組番隊隊長的永倉新八、原田左之助和齋藤一等人均要求撤退，但近藤勇則不許部下撤退，稱會津藩的援軍不久即將抵達。眼見戰況愈發不利，近藤勇又不肯撤退，故各自率領部下分散突圍，近藤勇眼見大勢已去，不得已也帶著部隊向後方撤退。此戰的失敗導致了甲陽鎮撫隊的兵力傷亡過半，而舊新選組幹部之間也爆發了嚴重衝突，最終這導致了永倉新八等人脫隊，齋藤一被解除指揮權。事實上，也就是從甲州勝沼之戰結束時，新選組就已經因人心潰散而名存實亡了。